BioAssay Systems 丙酮酸脫氫酶測定試劑盒-高靈敏度和寬線性范圍

丙酮酸脫氫酶（PDH）（E.C. 1.2.4.1）是一種氧化還原酶，催化丙酮酸的脫羧反應，生成乙酰化二氫硫辛酰胺，該反應依賴于硫胺素焦磷酸（TPP）。PDH是PDH復合體的E1組分，最終生成乙酰輔酶A。PDH復合體連接了糖酵解和檸檬酸循環。這種非放射性比色法PDH測定基于苯嗪甲磺酸（PMS）偶聯反應中四氮唑鹽MTT的還原，生成的還原型MTT在565nm處有最大吸收峰。生成的紫色強度與PDH活性成正比。

作為BioAssay Systems在中國的區域總代理，艾美捷科技強烈推薦BioAssay Systems熱銷產品丙酮酸脫氫酶測定試劑盒。產品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點：

-高靈敏度和寬線性范圍。檢測限為0.87 U/L，在96孔板測定中線性范圍可達至少278 U/L PDH。

-均質且簡單的操作程序。簡單的“混合-測量”程序可在20分鐘內可靠定量PDH活性。

-穩定且適用于高通量篩選（HTS）。所有試劑均與高通量液體處理儀器兼容。

應用領域：

-直接測定：生物樣本中的PDH活性。

-藥物發現：PDH調節劑的篩選和評估。

試劑盒組成（96孔板100次測試）：

-測定緩沖液：8.0 mL

-TPP溶液：500 uL

-PMS溶液：500 uL

-丙酮酸：500 uL

-MTT溶液：1.0 mL

-校準液：1.0 mL

儲存條件：試劑盒在室溫下運輸。收到后將所有組分儲存于-20°C。保質期：收貨后6個月。

注意事項：試劑僅供研究使用。使用試劑時應遵循實驗室試劑的常規注意事項。請參閱安全數據表以獲取詳細信息。

操作步驟：

本測定基于動力學反應。為確保孵育時間一致，加入工作試劑到樣本中的操作應迅速，混合應簡短但徹底。建議使用多通道移液器。測定可在室溫（25°C）或37°C下進行。

樣本準備：

-本測定使用從豬心臟中獲得的純化PDH（Sigma P7032）進行優化。對于未知樣本，建議用戶嘗試不同稀釋度的酶制劑以獲得最佳結果。

-組織：在解剖前，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）沖洗組織以去除血液。將組織在每克組織5 mL含有100 mM磷酸鉀（pH 7.0）和1 mM EDTA的緩沖液中勻漿。在4°C下以10,000 x g離心15分鐘。取上清液用于測定。

-細胞裂解液：通過在4°C下以2,000 x g離心5分鐘收集細胞。對于貼壁細胞，不要使用蛋白酶來收獲細胞，而是使用橡膠刮刀。在含有100 mM磷酸鉀（pH 7.0）和1 mM EDTA的冷緩沖液中適當體積中勻漿或超聲處理細胞。在4°C下以10,000 x g離心15分鐘。取上清液用于測定。

-所有樣本可以在-20至-80°C下保存至少一個月。

試劑準備：將試劑平衡至所需的反應溫度（例如25°C或37°C）。使用前短暫離心試劑管。

測定步驟：

1.將100 uL H?O（ODH?O）和100 uL校準液（ODCAL）溶液分別加入到96孔透明平底板的單獨孔中。

2.將每個樣本的20 uL分別加入到單獨的孔中，并將20 uL測定或樣本緩沖液加入到單獨的孔中，作為“無酶”空白。

   -為所有樣本孔（包括“無酶”空白孔）準備足夠量的工作試劑（WR）。對于每個孔，混合：10 uL MTT溶液、5 uL PMS溶液、5 uL TPP溶液、5 uL丙酮酸底物和60 uL測定緩沖液。需要現配現用。工作試劑應在使用前新鮮制備，并避光保存。

   -向每個樣本孔和“無酶”空白孔中加入80 uL新鮮WR。輕輕敲擊板以混勻。

3.立即在565nm處讀取吸光度（ODS0），并在20分鐘后再次讀取（ODS20）。（孵育期間應保護板免受光照。）

所需材料（未提供）：

-移液裝置及配件（例如多通道移液器）、96孔透明平底板（例如VWR貨號82050-760）或比色皿，以及能夠測量565nm吸光度的酶標儀或分光光度計。

實例：

在96孔板測定中對豬心臟PDH活性進行滴定。

文獻：

1. Gray, LR et al (2014) Regulation of pyruvate metabolism and human disease. Cell. Mol. Life. Sci. 71:2577-2604.

2. Ke, C-J et al (2014). A new spectrophotometric assay for measuring pyruvate dehydrogenase complex activity: a comparative evaluation.Anal. Methods. 6:6381-6388.

3. Sun, W et al (2015) The role of Pyruvate Dehydrogenase Complex in cardiovascular diseases. Life Sci. 121:97-103. 

BioAssay Systems是一家位于美國北加州灣區的高新技術生物技術公司，專注于研發、生產和銷售高品質的生化檢測試劑盒，產品種類齊全，主要用于科學研究和生物醫藥開發，以滿足生命科學行業日益增長的需求。BioAssay Systems在現代藥物發現領域擁有超過50年的豐富經驗，已經開發了超過250種用于藥物發現和生命科學研究的檢測試劑盒。產品主要包括：1.血液尿液化學；2.酶活性測定；3.能量代謝；4.氧化應激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽離子檢測。

作為BioAssay Systems在中國區域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的BioAssay Systems產品。