胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin，EC 3.4.21.1）是一種消化性絲氨酸蛋白酶，它在許多真核生物和原核生物中水解膳食蛋白質(zhì)。胰凝乳蛋白酶主要在芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的羧基側(cè)切割肽鏈。BioAssay Systems的QuantiFluo?胰凝乳蛋白酶抑制劑檢測(cè)試劑盒使用了一種熒光素異硫氰酸酯（FITC）標(biāo)記的合成底物。熒光素標(biāo)記的熒光被高度猝滅。當(dāng)樣本中的胰凝乳蛋白酶消化底物時(shí)，底物被切割成較小的肽段，從而消除了熒光猝滅。在λex/em = 485/530 nm處測(cè)量FITC標(biāo)記片段的熒光或熒光偏振（FP）。通過熒光的減少來確定抑制作用。

作為BioAssay Systems在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BioAssay Systems熱銷產(chǎn)品胰凝乳蛋白酶抑制劑試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點(diǎn)  

- 安全。非放射性檢測(cè)。  

- 均相且便捷。均相“混合-孵育-測(cè)量”型檢測(cè)法。無需洗滌和試劑轉(zhuǎn)移步驟。  

- 穩(wěn)定且高通量。可輕松自動(dòng)化，每天可檢測(cè)數(shù)千個(gè)樣本。檢測(cè)具有很高的穩(wěn)定性，Z’因子>0.8。

應(yīng)用  

- 用于評(píng)估藥物和篩選潛在的胰凝乳蛋白酶抑制劑。

試劑盒內(nèi)容（96孔板檢測(cè)100次）  

- 檢測(cè)緩沖液：10 mL  

- 底物：100 ?L  

儲(chǔ)存條件  

試劑盒在室溫下運(yùn)輸。收到后將所有組分儲(chǔ)存于-20°C。保質(zhì)期：收貨后6個(gè)月。

注意事項(xiàng)  

試劑僅供研究使用。使用試劑時(shí)應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室試劑的常規(guī)安全措施。請(qǐng)參考材料安全數(shù)據(jù)表以獲取詳細(xì)信息。

操作步驟  

- 在檢測(cè)前，將所有組分平衡至室溫。本檢測(cè)基于動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。為確保孵育時(shí)間一致，向樣本中加入工作試劑時(shí)應(yīng)迅速，混合應(yīng)簡(jiǎn)短但充分。建議使用多通道移液器。檢測(cè)可在室溫下進(jìn)行。注意：本試劑盒不包括酶或抑制劑。客戶需自行提供所需的酶或抑制劑。

樣本準(zhǔn)備：  

- 為防止自消化，純胰凝乳蛋白酶溶液可在酸性條件下（1 mM HCl，pH 3.0）長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80°C。可加入2 mM CaCl?以穩(wěn)定儲(chǔ)存液。將純化的胰凝乳蛋白酶稀釋于檢測(cè)緩沖液中。胰凝乳蛋白酶應(yīng)置于冰上，并盡快使用。在本實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)孔中使用了10 U/mL的胰凝乳蛋白酶。將測(cè)試化合物溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲校ɡ鏒MSO）。在使用之前，應(yīng)先測(cè)試酶對(duì)溶劑的耐受性。對(duì)于豬胰凝乳蛋白酶，檢測(cè)中DMSO的最終濃度應(yīng)<2%。

96孔板抑制劑篩選：  

1. 將30 ?L胰凝乳蛋白酶分別加入黑色平底96孔板的不同孔中（反應(yīng)中為10 U/mL胰凝乳蛋白酶）。同時(shí)，分別準(zhǔn)備30 ?L胰凝乳蛋白酶（“對(duì)照”）和30 ?L檢測(cè)緩沖液（“空白”）孔。  

2. 向?qū)φ蘸涂瞻卓字屑尤?0 ?L溶解測(cè)試化合物的緩沖液溶劑。例如，如果測(cè)試化合物溶解于含有0.1% DMSO的緩沖液中，則向這些孔中加入10 ?L該溶液。  

3. 向其余含有酶的孔中加入10 ?L測(cè)試化合物。輕拍平板混合，并在室溫下孵育15分鐘，以使抑制劑阻斷酶活性。  

4. 通過將1 ?L底物和99 ?L檢測(cè)緩沖液混合，為每個(gè)孔準(zhǔn)備足夠量的工作試劑。向所有孔中加入80 ?L工作試劑。輕拍平板混合。在室溫下避光孵育30分鐘。在λex/em = 485/530 nm處讀取熒光或熒光偏振（FP）。

所需材料（但未提供）  

- 純化的胰凝乳蛋白酶（例如MedChemExpress，貨號(hào)HY108910）以及（如果需要）胰凝乳蛋白酶抑制劑對(duì)照（例如大豆胰蛋白酶抑制劑，Cayman Chemical，貨號(hào)14502）。  

- 移液裝置及配件（例如多通道移液器）、黑色平底96孔板（例如Corning Costar）、離心管，以及能夠讀取λex/em = 485/530 nm處熒光或熒光偏振的微孔板讀數(shù)儀。

胰凝乳蛋白酶抑制曲線  ：

- 左圖：胰凝乳蛋白酶與不同濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑孵育，生成熒光IC??曲線。  

- 右圖：為熒光偏振（FP）測(cè)量生成了第二個(gè)IC??曲線。

文學(xué)：

1. López-Otín, C., Bond, J. S. (2008). Proteases: multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry, 283(45): 30433–30437.

2. Shah, D., Mital, K. (2018). The Role of Trypsin: Chymotrypsin in Tissue Repair. Advances in Therapy, 35(1): 31–42.

3. Vreeke, G. J. C., et al. (2023). The path of proteolysis by bovine chymotrypsin. Food research international (Ottawa, Ont.), 165: 112485. 

BioAssay Systems是一家位于美國(guó)北加州灣區(qū)的高新技術(shù)生物技術(shù)公司，專注于研發(fā)、生產(chǎn)和銷售高品質(zhì)的生化檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品種類齊全，主要用于科學(xué)研究和生物醫(yī)藥開發(fā)，以滿足生命科學(xué)行業(yè)日益增長(zhǎng)的需求。BioAssay Systems在現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域擁有超過50年的豐富經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)開發(fā)了超過250種用于藥物發(fā)現(xiàn)和生命科學(xué)研究的檢測(cè)試劑盒。產(chǎn)品主要包括：1.血液尿液化學(xué)；2.酶活性測(cè)定；3.能量代謝；4.氧化應(yīng)激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽離子檢測(cè)。

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