胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）是一種消化性絲氨酸蛋白酶，能夠在許多真核生物和原核生物中水解膳食蛋白質(zhì)。胃蛋白酶主要在芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基側(cè)切斷肽鏈。BioAssay Systems 的 QuantiFluo? 胃蛋白酶抑制劑檢測試劑盒使用了一種熒光素異硫氰酸酯（FITC）標(biāo)記的合成底物。熒光素標(biāo)記的熒光被高度猝滅。當(dāng)樣本中的胃蛋白酶對(duì)底物進(jìn)行消化時(shí)，底物被分解成更小的肽段，從而消除了熒光猝滅。通過在 λex/em = 485/530 nm 處測量 FITC 標(biāo)記片段的熒光或熒光偏振（FP），抑制率通過熒光強(qiáng)度的降低來確定。

作為BioAssay Systems在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BioAssay Systems熱銷產(chǎn)品胃蛋白酶抑制劑測定試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點(diǎn)：

- 安全：非放射性檢測。

- 均相且便捷：均相“混合-孵育-測量”型檢測。無需洗滌和試劑轉(zhuǎn)移步驟。

- 穩(wěn)健且高通量：可輕松自動(dòng)化，每天檢測數(shù)千個(gè)樣本。穩(wěn)健的檢測方法，Z’因子大于 0.7。

應(yīng)用：

- 用于評(píng)估藥物和篩選胃蛋白酶蛋白酶的潛在抑制劑。

試劑盒內(nèi)容（96 孔板 100 次檢測）：

- 檢測緩沖液：20 mL

- 底物：100 uL

儲(chǔ)存條件：試劑盒在室溫下運(yùn)輸。收到后將所有組分儲(chǔ)存于 -20°C。保質(zhì)期：收到后 6 個(gè)月。

注意事項(xiàng)：試劑僅供研究使用。使用試劑時(shí)應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室試劑的常規(guī)注意事項(xiàng)。請(qǐng)參閱材料安全數(shù)據(jù)表以獲取詳細(xì)信息。

操作步驟：

- 在檢測前，將所有組分平衡至室溫。該檢測基于動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。為確保相同的孵育時(shí)間，向樣本中添加工作試劑的操作應(yīng)迅速，混合應(yīng)簡短但充分。建議使用多通道移液器。檢測可在室溫下進(jìn)行。注意：本試劑盒不包含酶或抑制劑。客戶需自行提供所需的酶或抑制劑。

- 樣本準(zhǔn)備：

- 為了降低自消化速度，純胃蛋白酶溶液可在酸性條件下（10 mM HCl，pH 2.0）長期儲(chǔ)存于 -80°C。在檢測前，準(zhǔn)備足夠的 10 mM HCl（例如 10 mL），用于 96 孔板的所有測試孔。將純化的胃蛋白酶稀釋于 HCl 溶液中。胃蛋白酶應(yīng)置于冰上，并盡快使用。將測試化合物溶解于選定的溶劑中（例如 DMSO）。建議首先測試溶劑對(duì)所選酶的耐受性。對(duì)于豬胃蛋白酶，檢測中 DMSO 的最終濃度應(yīng)小于 2%。為了獲得最佳的胃蛋白酶活性條件，建議將化合物溶解于酸性溶劑（例如 10 mM HCl，pH 2.0）中。

- 96 孔板中的抑制劑篩選：

1. 將 30 uL 的 27 U/L 胃蛋白酶（反應(yīng)中的最終濃度為 5.4 U/L）分別轉(zhuǎn)移至黑色平底 96 孔板的各個(gè)孔中。另外，分別準(zhǔn)備 30 uL 的胃蛋白酶（“對(duì)照”）和 30 uL 的 10 mM HCl（“空白”）孔。

2. 向?qū)φ湛缀涂瞻卓字屑尤?10 uL 溶解測試化合物的緩沖液溶劑。例如，如果測試化合物溶解于含有 0.1% DMSO 的 10 mM HCl 中，則向這些孔中加入該溶液 10 uL。

3. 向其余含有酶的孔中加入 10 uL 測試化合物（所需濃度）。輕拍平板以混合，并在室溫下孵育 15 分鐘，使抑制劑阻斷胃蛋白酶活性。

4. 通過將 0.5 uL 底物和 12 uL 10 mM HCl 混合，為所有孔準(zhǔn)備足夠量的工作試劑。向所有孔中加入 10 uL 工作試劑。輕拍平板以混合。在室溫下避光孵育 30 分鐘。

5. 向所有孔中加入 100 uL 檢測緩沖液以中和熒光底物，并在 λex/em = 485/530 nm 處讀取熒光或熒光偏振。

所需材料（但未提供）：

- 10 mM HCl 溶液，純胃蛋白酶（例如 MP Biomedicals，貨號(hào) 102598），以及如果需要的話，胃蛋白酶抑制劑對(duì)照品（例如 Pepstatin A，Cayman Chemical，貨號(hào) 9000469）。移液裝置及配件（例如多通道移液器）、黑色平底 96 孔板（例如 Corning Costar）、離心管和能夠讀取 λex/em = 485/530 nm 處熒光或熒光偏振的酶標(biāo)儀。

實(shí)例：

胃蛋白酶抑制曲線。左圖：胃蛋白酶與各種以產(chǎn)生熒光IC50曲線。右：A使用FP測量生成第二IC50曲線。

文獻(xiàn)：

1. López-Otín, C., Bond, J. S. (2008). Proteases: multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry, 283(45): 30433–30437.

2. Marciniszyn, J., Jr, Hartsuck, J. A., & Tang, J. (1977). Pepstatin inhibition mechanism. Advances in experimental medicine and biology, 95, 199–210.

3. Sancho, J and Campos, L. (2003). The active site of pepsin is formed in the intermediate conformation dominant at mildly acidic pH. FEBS Letters, 538(1-3): 89-95. 

BioAssay Systems是一家位于美國北加州灣區(qū)的高新技術(shù)生物技術(shù)公司，專注于研發(fā)、生產(chǎn)和銷售高品質(zhì)的生化檢測試劑盒，產(chǎn)品種類齊全，主要用于科學(xué)研究和生物醫(yī)藥開發(fā)，以滿足生命科學(xué)行業(yè)日益增長的需求。BioAssay Systems在現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域擁有超過50年的豐富經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)開發(fā)了超過250種用于藥物發(fā)現(xiàn)和生命科學(xué)研究的檢測試劑盒。產(chǎn)品主要包括：1.血液尿液化學(xué)；2.酶活性測定；3.能量代謝；4.氧化應(yīng)激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽離子檢測。

作為BioAssay Systems在中國區(qū)域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的BioAssay Systems產(chǎn)品。