無機(jī)焦磷酸酶（E.C.3.6.1.1）催化無機(jī)焦磷酸鹽 [P?O???] 的磷酸酯鍵水解，從而釋放出兩個(gè)正磷酸分子。I 型焦磷酸酶是存在于所有生物界中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)維持正確的焦磷酸平衡，這對于核酸和蛋白質(zhì)合成以及促進(jìn)脂肪酸β-氧化是必要的。能夠簡單、直接且適合自動(dòng)化的焦磷酸酶活性檢測程序是非常理想的。BioAssay Systems 的 DPPT-100 檢測試劑盒基于我們專有的磷酸鹽檢測試劑盒（POMG-25H）。在 620 nm 處測量的吸光度與焦磷酸水解所釋放的磷酸量成正比。

作為BioAssay Systems在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BioAssay Systems熱銷產(chǎn)品焦磷酸酶測定試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點(diǎn)：

- 安全且靈敏：非放射性檢測。可使用低至 10 ?L 的樣本。96 孔板的線性檢測范圍為 1.0 至 20 U/L 活性。

- 快速便捷：操作過程僅涉及加入單一工作試劑并孵育 60 分鐘。室溫檢測，無需 37°C 孵育箱。

- 高通量：均相“混合-孵育-測量”型檢測。可輕松自動(dòng)化，每天檢測數(shù)千個(gè)樣本。

應(yīng)用：

- 用于檢測和定量焦磷酸酶活性。

試劑盒內(nèi)容（96 孔板 100 次檢測）：

- 檢測緩沖液（pH 7.2）：8 mL

- POMG 試劑 A：2.5 mL

- 焦磷酸鹽：100 ?L

- POMG 試劑 B：120 ?L

- 標(biāo)準(zhǔn)品：120 ?L（1 mM 磷酸）

儲(chǔ)存條件：試劑盒在室溫下運(yùn)輸。收到后將所有組分儲(chǔ)存于 4°C。保質(zhì)期：收到后 6 個(gè)月。

注意事項(xiàng)：試劑僅供研究使用。使用試劑時(shí)應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室試劑的常規(guī)注意事項(xiàng)。請參閱材料安全數(shù)據(jù)表以獲取詳細(xì)信息。

操作步驟：

- 樣本準(zhǔn)備：在制備焦磷酸酶樣本時(shí)，必須避免使用含有磷酸鹽的洗滌劑和緩沖液，因?yàn)樵摍z測對游離磷酸鹽極為敏感。如果單獨(dú)酶與顯色試劑的 OD???nm 大于 0.2，建議使用 10 kDa NMWL 膜濾器（例如 Amicon? Ultra 0.5 mL Ultracel 或類似產(chǎn)品）至少?zèng)_洗 3 次以去除游離磷酸鹽。避免使用含有 EDTA 和金屬（如 Zn、Co、Mn 和 Ca）的樣本。高濃度蛋白質(zhì)可能會(huì)通過沉淀干擾顯色反應(yīng)。對于活性未知的酶樣本，建議在 dH?O 中進(jìn)行系列稀釋，以使活性處于檢測范圍內(nèi)，并選擇無沉淀發(fā)生的稀釋倍數(shù)。

- 1. 酶反應(yīng)：

- 將 10 ?L 焦磷酸酶樣本分別轉(zhuǎn)移至透明平底 96 孔板的不同孔中。為每個(gè)樣本預(yù)留一個(gè)孔作為空白（10 ?L 緩沖液，不含酶）。

- 通過將每孔的 1 ?L 焦磷酸鹽與 80 ?L 檢測緩沖液混合，為所有檢測孔制備足夠量的工作試劑（WR）。

- 通過向每個(gè)孔中加入 70 ?L WR 啟動(dòng)反應(yīng)。輕輕敲擊平板以混合反應(yīng)液。

- 在室溫或所需溫度下孵育平板 30 分鐘。

- 2. 磷酸鹽測定：

- 通過將 20 ?L 1 mM 磷酸標(biāo)準(zhǔn)品加入 480 ?L dH?O 中，制備 40 ?M 磷酸預(yù)混液。按表格所示編號并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

- 將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的 80 ?L 雙份轉(zhuǎn)移至檢測板的不同孔中。

- 準(zhǔn)備顯色試劑。每個(gè)孔需要 20 ?L 顯色試劑，通過將 100 體積的 POMG 試劑 A 與 1 體積的 POMG 試劑 B 混合制備（例如 1 mL 試劑 A 和 10 ?L 試劑 B）。制備好的試劑在室溫下至少穩(wěn)定 1 天。

- 在第 1 步的 30 分鐘時(shí)，向每個(gè)孔中加入 20 ?L 顯色試劑。輕輕敲擊平板混合，并在室溫下額外孵育 30 分鐘以顯色。

- 3. 在酶標(biāo)儀上測量 600 nm - 660 nm（峰值 620 nm）處的吸光度。

- 注意：如果觀察到的磷酸鹽濃度等于或高于 40 ?M 磷酸標(biāo)準(zhǔn)品，請將酶提取液稀釋于緩沖液中，并重復(fù)檢測。

所需材料（但未提供）：

- 移液裝置（多通道）。透明底 96 孔板（例如 Corning Costar）和酶標(biāo)儀。10 kDa NMWL 膜濾器。

實(shí)例：

- 左側(cè)：磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。

- 右側(cè)：使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔檢測程序?qū)沽姿崦高M(jìn)行滴定。所用酶為釀酒酵母焦磷酸酶（Sigma 編號 I1643-100 UN）。

文獻(xiàn)：

1. Yang, L., Liao, R. Z., Yu, J. G., & Liu, R. Z. (2009). DFT study on the mechanism of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. The Journal of Physical Chemistry B, 113(18), 6505-6510.

2. Carman, G. M., & Han, G. S. (2006). Roles of phosphatidate phosphatase enzymes in lipid metabolism. Trends in biochemical sciences, 31(12), 694-699.

3. Nakano, T., et al (1999) Purification and Characterization of Phytase from Bran of Triticum aestivum L. cv. Nourin #61. Food Sci. Technol.Res. 5(1): 18.

BioAssay Systems是一家位于美國北加州灣區(qū)的高新技術(shù)生物技術(shù)公司，專注于研發(fā)、生產(chǎn)和銷售高品質(zhì)的生化檢測試劑盒，產(chǎn)品種類齊全，主要用于科學(xué)研究和生物醫(yī)藥開發(fā)，以滿足生命科學(xué)行業(yè)日益增長的需求。BioAssay Systems在現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域擁有超過50年的豐富經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)開發(fā)了超過250種用于藥物發(fā)現(xiàn)和生命科學(xué)研究的檢測試劑盒。產(chǎn)品主要包括：1.血液尿液化學(xué)；2.酶活性測定；3.能量代謝；4.氧化應(yīng)激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽離子檢測。

作為BioAssay Systems在中國區(qū)域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的BioAssay Systems產(chǎn)品。