無(wú)機(jī)焦磷酸酶（E.C.3.6.1.1）催化無(wú)機(jī)焦磷酸鹽 [P?O???] 的磷酸酯鍵水解，從而釋放出兩個(gè)正磷酸分子。I 型焦磷酸酶是在所有生物界中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)維持正確的焦磷酸平衡，這對(duì)于核酸和蛋白質(zhì)合成以及促進(jìn)脂肪酸β-氧化是必要的。BioAssay Systems 的 QuantiChrom? 焦磷酸酶抑制劑檢測(cè)試劑盒基于我們的焦磷酸酶檢測(cè)試劑盒（DPPT-100），可用于篩選潛在的焦磷酸酶抑制劑。

作為BioAssay Systems在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BioAssay Systems熱銷產(chǎn)品焦磷酸酶抑制劑試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點(diǎn)：

- 安全：非放射性檢測(cè)。

- 快速便捷：操作過(guò)程包括酶和抑制劑的孵育、加入單一工作試劑并孵育 30 分鐘。

- 室溫檢測(cè)：無(wú)需 37°C 孵育箱。

- 高通量：均相“混合-孵育-測(cè)量”型檢測(cè)。可在高通量篩選液體處理系統(tǒng)上輕松自動(dòng)化。穩(wěn)健的檢測(cè)方法，Z’因子為 0.59。可用于 96 孔、384 孔，甚至更高密度的篩選檢測(cè)。

應(yīng)用：

- 用于高通量抑制劑篩選和焦磷酸酶調(diào)節(jié)劑的評(píng)估。

試劑盒內(nèi)容（96 孔板 100 次檢測(cè)）：

- 檢測(cè)緩沖液：8 mL

- POMG 試劑 A：2.5 mL

- 焦磷酸鹽：100 uL

- POMG 試劑 B：120 uL

- 抑制劑：100 uL

儲(chǔ)存條件：試劑盒在室溫下運(yùn)輸。收到后將焦磷酸鹽儲(chǔ)存于 -20°C，其他所有組分儲(chǔ)存于 4°C。保質(zhì)期：收到后 6 個(gè)月。

注意事項(xiàng)：試劑僅供研究使用。使用試劑時(shí)應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室試劑的常規(guī)注意事項(xiàng)。請(qǐng)參閱材料安全數(shù)據(jù)表以獲取詳細(xì)信息。

操作步驟：

- 測(cè)試化合物準(zhǔn)備：將測(cè)試化合物溶解于選定的溶劑中（例如 H?O、DMSO）。如果溶劑不是 H?O，建議先測(cè)試所選酶對(duì)溶劑的耐受性。在我們的測(cè)試中，酵母焦磷酸酶（Sigma Aldrich 編號(hào) I1643）可耐受高達(dá) 10% 的 DMSO。

- 酶準(zhǔn)備：酶應(yīng)在酶緩沖液中制備，例如 25 mM HEPES（pH 7.2）、5 mM MgCl?。以下協(xié)議針對(duì)酵母焦磷酸酶（Sigma Aldrich 編號(hào) I1643）進(jìn)行了優(yōu)化。酶應(yīng)在檢測(cè)前稀釋。如果使用不同的酶，建議在 dH?O 中進(jìn)行酶的系列稀釋，以確定每孔使用的最佳酶濃度。

- 注意：

1. 酶緩沖液（例如來(lái)自洗滌劑）和測(cè)試化合物中的磷酸鹽應(yīng)進(jìn)行測(cè)試和/或避免，因?yàn)樵摍z測(cè)對(duì)游離磷酸鹽極為敏感。如果單獨(dú)酶與顯色試劑的 OD???nm 大于 0.2，建議使用 10 kDa NMWL 膜濾器（例如 Amicon? Ultra 0.5 mL Ultracel 或類似產(chǎn)品）至少?zèng)_洗 3 次以去除游離磷酸鹽。

2. 避免使用 EDTA 和可能影響酶活性的金屬（如 Zn、Co、Mn 和 Ca）。

3. 高濃度蛋白質(zhì)可能會(huì)通過(guò)沉淀干擾顯色反應(yīng)。

96 孔板中的抑制劑篩選：

1. 將 10 uL 酶分別轉(zhuǎn)移至透明平底 96 孔板的不同孔中。至少預(yù)留一個(gè)孔作為無(wú)抑制劑對(duì)照（“對(duì)照”）和一個(gè)孔作為無(wú)酶空白（“空白”）：分別向?qū)φ湛缀涂瞻卓字屑尤?10 uL 酶樣本和 10 uL 檢測(cè)緩沖液。

- 向?qū)φ湛缀涂瞻卓字屑尤?10 uL 溶解測(cè)試化合物的溶劑溶液。例如，如果測(cè)試化合物溶解于 0.5% DMSO 中，則向這些孔中加入該溶液 10 uL。

2. 向其余含有酶的孔中加入 10 uL 測(cè)試化合物。輕拍平板以混合（確保酶和抑制劑混合均勻），在室溫下孵育 10 分鐘，使抑制劑阻斷酶活性。

3. 通過(guò)將每孔的 1 uL 焦磷酸鹽與 80 uL 檢測(cè)緩沖液混合，為所有孔準(zhǔn)備足夠量的工作試劑（WR）。將 70 uL WR 轉(zhuǎn)移至所有孔中。輕拍平板以混合。在室溫下孵育 30 分鐘。

4. 通過(guò)將 100 份 POMG 試劑 A 與 1 份 POMG 試劑 B 混合，為所有孔準(zhǔn)備足夠量的顯色試劑。向所有孔中加入 20 uL 顯色試劑。徹底輕拍平板以混合。在室溫下孵育 30 分鐘，并讀取 620 nm 處的吸光度。

實(shí)例：

酵母焦磷酸酶（Sigma Aldrich 編號(hào) I1643，濃度為 10 U/L）與不同濃度的 NaF 和 EDTA 在室溫下孵育 10 分鐘。酶反應(yīng)和檢測(cè)按照標(biāo)準(zhǔn)程序在 96 孔板中進(jìn)行。注意：檢測(cè)緩沖液中含有 EDTA。

文獻(xiàn)：

1. Yang, L., Liao, R. Z., Yu, J. G., & Liu, R. Z. (2009). DFT study on the mechanism of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. The Journal of Physical Chemistry B, 113(18), 6505-6510.

2. Carman, G. M., & Han, G. S. (2006). Roles of phosphatidate phosphatase enzymes in lipid metabolism. Trends in biochemical sciences, 31(12), 694-699.

3. Nakano, T., et al (1999) Purification and Characterization of Phytase from Bran of Triticum aestivum L. cv. Nourin #61. Food Sci. Technol.Res. 5(1): 18.

BioAssay Systems是一家位于美國(guó)北加州灣區(qū)的高新技術(shù)生物技術(shù)公司，專注于研發(fā)、生產(chǎn)和銷售高品質(zhì)的生化檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品種類齊全，主要用于科學(xué)研究和生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)，以滿足生命科學(xué)行業(yè)日益增長(zhǎng)的需求。BioAssay Systems在現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域擁有超過(guò)50年的豐富經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了超過(guò)250種用于藥物發(fā)現(xiàn)和生命科學(xué)研究的檢測(cè)試劑盒。產(chǎn)品主要包括：1.血液尿液化學(xué)；2.酶活性測(cè)定；3.能量代謝；4.氧化應(yīng)激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽(yáng)離子檢測(cè)。

作為BioAssay Systems在中國(guó)區(qū)域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國(guó)客戶提供全面的BioAssay Systems產(chǎn)品。