吡啶核苷酸在代謝中發(fā)揮重要作用，因此，監(jiān)測其濃度水平一直備受關(guān)注。 NADP?/NADPH的定量測定在涉及細(xì)胞或組織能量轉(zhuǎn)換和氧化還原狀態(tài)的研究中具有應(yīng)用價值。簡單、直接且適合自動化的NADP?/NADPH濃度測量程序非常受歡迎。BioAssay Systems的EnzyChrom? NADP?/NADPH檢測試劑盒基于葡萄糖脫氫酶循環(huán)反應(yīng)，其中生成的NADPH還原甲臜（MTT）試劑。在565 nm處測量的還原產(chǎn)物顏色強(qiáng)度與樣本中的NADP?/NADPH濃度成正比。該檢測對NADP?/NADPH具有高度特異性，且不受NAD?/NADH的干擾。我們的檢測方法是一種方便測量NADP、NADPH及其比例的方法。

作為BioAssay Systems在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BioAssay Systems熱銷產(chǎn)品【干冰】EnzyChrom NADP+/NADPH檢測試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用：

直接檢測：細(xì)胞或組織提取物中的NADP?/NADPH濃度及其比例。

主要特點：

靈敏且準(zhǔn)確。96孔板檢測的檢測限為0.1 uM，線性范圍可達(dá)10 uM NADP+/NADPH。

方便。操作步驟簡單，只需加入一種工作試劑，并在室溫下分別于0時刻和30分鐘時讀取吸光度。無需37°C加熱器。

高通量。可作為高通量96孔板檢測方法，每天可處理數(shù)千個樣本。

試劑盒組成（96孔板進(jìn)行100次檢測）：

檢測緩沖液：10 mL

酶A：120 uL

MTT溶液：1.5 mL

酶B：120 uL

G6P：120 uL

NADP標(biāo)準(zhǔn)品：0.5 mL（1 mM）

NAD(P)/NAD(P)H提取緩沖液：各12 mL

儲存條件：試劑盒在冰上運(yùn)輸。將所有試劑儲存于-20°C。保質(zhì)期：收貨后6個月。

注意事項：試劑僅供研究使用。使用試劑時應(yīng)遵循實驗室試劑的常規(guī)注意事項。請參閱材料安全數(shù)據(jù)表以獲取詳細(xì)信息。

檢測步驟：

1. 樣本準(zhǔn)備。對于組織樣本，每份稱取約20 mg組織，用冰冷的PBS洗滌。對于細(xì)胞樣本，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞，并每份收集約10?個細(xì)胞。將樣本（組織或細(xì)胞）在1.5 mL離心管中用100 uL NADP提取緩沖液（用于NADP測定）或100 uL NADPH提取緩沖液（用于NADPH測定）進(jìn)行勻漿。將提取物在60°C加熱5分鐘，然后加入20 uL檢測緩沖液和100 uL另一種提取緩沖液以中和提取物。短暫渦旋振蕩后，以14,000 rpm離心5分鐘。使用上清液進(jìn)行NADP/NADPH檢測。測定NADP和NADPH濃度需要分別從兩個獨立樣本中提取。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。將5 uL 1 mM標(biāo)準(zhǔn)品與495 uL蒸餾水混合，制備500 uL 10 uM NADP預(yù)混合液。將40 uL標(biāo)準(zhǔn)品分別加入透明底96孔板的各個孔中。

樣本：每孔加入40 uL樣本，分別置于不同的孔中。

3. 試劑準(zhǔn)備。為獲得最佳結(jié)果，建議在制備工作試劑前將酶恢復(fù)至室溫（15-30分鐘）。對于每個反應(yīng)孔，通過混合80 uL檢測緩沖液、1 uL酶A、1 uL酶B、1 uL G6P和14 uL MTT來制備工作試劑。建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 反應(yīng)。每孔快速加入80 uL工作試劑。輕拍平板以短暫但充分混合。

5. 讀取吸光度。在565 nm（520-600 nm）處讀取0時刻的吸光度（OD?）和室溫孵育30分鐘后的吸光度（OD??）。

6. 計算。從標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔的OD30中減去OD0。使用ΔOD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定樣本的NADP/NADPH濃度。

注意：如果樣本的ΔOD值高于10 uM標(biāo)準(zhǔn)品的ΔOD值，則用蒸餾水稀釋樣本并重復(fù)檢測。將結(jié)果乘以稀釋因子。

一般注意事項：

1. 在這些濃度下，NADP和NADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線是相同的。由于溶液中的NADPH不穩(wěn)定，我們僅提供NADP作為標(biāo)準(zhǔn)品。

2. 該檢測基于酶催化的動力學(xué)反應(yīng)。加入工作試劑應(yīng)迅速，混合應(yīng)簡短但要充分。推薦使用多通道移液器。

3. 以下物質(zhì)會干擾檢測，應(yīng)在樣本準(zhǔn)備中避免使用：EDTA（>0.5 mM）、抗壞血酸、SDS（>0.2%）、NaN3、NP-40（>1%）和Tween-20（>1%）。

文獻(xiàn)參考：

1. Kwak, S., et al. (2020). Redirection of the glycolytic flux enhances isoprenoid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal 15(2): e1900173.

2. Zhang, Y., et al. (2021). Hepatic stellate cells specific liposomes with the Toll-like receptor 4 shRNA attenuates liver fibrosis. Journal of Cellular and Molecular Medicine 25(2): 1299-1313.

3. Hu, Li, et al (2019). Melatonin decreases M1 polarization via attenuating mitochondrial oxidative damage depending on UCP2 pathway in prorenin-treated microglia. PloS one 14.2: e0212138. 

BioAssay Systems是一家位于美國北加州灣區(qū)的高新技術(shù)生物技術(shù)公司，專注于研發(fā)、生產(chǎn)和銷售高品質(zhì)的生化檢測試劑盒，產(chǎn)品種類齊全，主要用于科學(xué)研究和生物醫(yī)藥開發(fā)，以滿足生命科學(xué)行業(yè)日益增長的需求。BioAssay Systems在現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域擁有超過50年的豐富經(jīng)驗，已經(jīng)開發(fā)了超過250種用于藥物發(fā)現(xiàn)和生命科學(xué)研究的檢測試劑盒。產(chǎn)品主要包括：1.血液尿液化學(xué)；2.酶活性測定；3.能量代謝；4.氧化應(yīng)激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽離子檢測。

作為BioAssay Systems在中國區(qū)域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的BioAssay Systems產(chǎn)品。