葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）是一種位于磷酸戊糖途徑中的細胞質酶，通過維持輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的水平為細胞提供還原能量。G6PDH將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）還原為NADPH，同時氧化葡萄糖-6-磷酸（G6P）。人類如果遺傳性缺乏G6PDH，則容易患非免疫性溶血性貧血。最近的研究發(fā)現，G6PDH在癌細胞的存活、增殖和轉移中起著關鍵作用。因此，該酶的抑制劑是開發(fā)新型抗癌療法的有吸引力的候選藥物。

BioAssay Systems的非放射性比色G6PDH測定基于NADPH耦聯(lián)的酶促反應中四氮唑鹽MTT的還原。MTT還原形式在565納米處有最大吸收峰。565納米處吸光度的增加與酶活性成正比。通過比較經測試化合物處理的G6PDH的活性與未經處理的G6PDH的活性，可以確定測試化合物的抑制百分比。

作為BioAssay Systems在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦BioAssay Systems熱銷產品葡萄糖-6-磷酸脫氫酶抑制劑篩選試劑盒。產品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點：

- 安全：非放射性測定。

- 高通量：均質“混合-孵育-測量”型測定，可輕松在高通量篩選液體處理系統(tǒng)上自動化操作。

- 快速可靠：可在30分鐘內完成，無需37攝氏度加熱器。

應用范圍：

- 高通量篩選葡萄糖-6-磷酸脫氫酶抑制劑并評估其效果。

試劑盒組成（96孔板，100次測試）：

- 測定緩沖液：10毫升

- 二氫酶：120微升

- NADP/MTT：1毫升

- 10×底物：100微升（450毫摩爾/升G6P）

儲存條件：

- 試劑盒在常溫下運輸。收到后將所有組分儲存于-20攝氏度。有效期：收到后6個月。

注意事項：

- 試劑僅供研究使用。使用試劑時應遵循實驗室試劑的常規(guī)預防措施。請參閱材料安全數據表以獲取詳細信息。

操作步驟：

該測定基于動力學反應。為確保孵育時間一致，加入工作試劑的操作應迅速，混合應簡短但徹底。建議使用多通道移液器。可在任何所需溫度（例如25攝氏度或37攝氏度）下進行測定。

樣本準備：

- 以下協(xié)議針對L. Mesenteroides的G6PDH進行了優(yōu)化。使用去離子水將純化的G6PDH稀釋至0.0003 U/微升。如果分析其他物種，建議您通過實驗確定Km值，然后調整工作試劑中的底物體積，使100微升反應中的底物最終濃度接近Km值。

- 將測試化合物溶解于所選溶劑中。如果使用DMSO或DMF，建議先測試所選酶對DMSO和DMF的耐受性。對于L. Mesenteroides的G6PDH，加入反應中的5微升測試化合物的DMSO濃度應不超過2體積百分比（v/v%）；而DMF濃度應不超過40體積百分比（v/v%）。

G6PDH反應準備：

1. 將20微升G6PDH分別加入不同的孔中。

2. 保留兩個含有G6PDH的孔，一個用于空白（無底物），一個用于對照（無抑制劑）。

3. 向對照和空白孔中加入5微升測試化合物所溶解的溶劑。例如，如果測試化合物溶解于2體積百分比（v/v%）的DMSO中，則向這些孔中加入5微升2體積百分比（v/v%）的DMSO。

4. 向其余含有G6PDH的孔中加入5微升測試化合物。輕拍孔板以混合。

5. 在25攝氏度下孵育孔板15分鐘。

6. 通過將10×底物在去離子水中稀釋10倍來準備足夠的1×底物。（每個反應孔需要8微升1×底物）

7. 通過混合為每個孔（除空白孔外）準備足夠的反應混合液（RM）：70微升測定緩沖液、8微升NAD/MTT、1微升二氫酶和8微升1×底物。

 通過混合為每個空白孔準備空白反應混合液（BRM）：70微升測定緩沖液、8微升NAD/MTT、1微升二氫酶和8微升去離子水（無1×底物）。

 向空白孔中加入75微升BRM。向其余孔中加入75微升RM。輕拍孔板以簡短但徹底地混合。

8. 在室溫下孵育孔板15分鐘，并在565納米處讀取吸光度。

所需材料（但未提供）：

- 純化的G6PDH（例如Calzyme產品編號078A0020），如果需要，還可以使用鋅離子抑制劑（例如Zn(NO?)?·6H?O，Sigma產品編號228737）。

- 移液裝置及配件（例如多通道移液器）、透明平底96孔板（例如VWR產品編號82050-760）和酶標儀。

Zn（NO3）2滴定：將來自腸系膜乳桿菌的G6PDH與dH20中不同濃度的Zn（NO3）2。

文獻參考：

1. Zhang, Zhaoyun, et al. (2010) High glucose inhibits glucose-6-phosphate dehydrogenase, leading to increased oxidative stress and β-cell apoptosis. The FASEB Journal 24.5: 1497-1505.

2. Tian, Wang-Ni, et al. (1998) Importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity for cell growth. Journal of Biological Chemistry 273.17:10609-10617.

3. Atamanalp, M., et al. (2016) Investigation of in vitro effects of some metal ions on glucose 6-phosphate dehydrogenase which purified from freshwater fish Capoeta umbla Kidney. HydroMediT 2016: 39

BioAssay Systems是一家位于美國北加州灣區(qū)的高新技術生物技術公司，專注于研發(fā)、生產和銷售高品質的生化檢測試劑盒，產品種類齊全，主要用于科學研究和生物醫(yī)藥開發(fā)，以滿足生命科學行業(yè)日益增長的需求。BioAssay Systems在現代藥物發(fā)現領域擁有超過50年的豐富經驗，已經開發(fā)了超過250種用于藥物發(fā)現和生命科學研究的檢測試劑盒。產品主要包括：1.血液尿液化學；2.酶活性測定；3.能量代謝；4.氧化應激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽離子檢測。

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