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我們知道，ProSpec 相當(dāng)一部分細(xì)胞因子和蛋白為凍干粉，這使得運(yùn)輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細(xì)胞因子和蛋白 凍干粉非常穩(wěn)定，在-20℃或-80℃條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系。溶解步驟非 常關(guān)鍵，因溶解不好會導(dǎo)致細(xì)胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實(shí)際使用中經(jīng)常遇到的問題。

那么，應(yīng)該如何進(jìn)行正確的溶解呢？ 

下面我們以 Recombinant Human IL-4 (重組人 IL-4，產(chǎn)品編號：CYT-211)的說明書為例，對細(xì)胞因子或蛋白的溶解方法 進(jìn)行詳細(xì)的闡述。 

拿到重組人 IL-4 的說明書后，您會發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于 Reconstitution(重懸)的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening  

第 1 步：開蓋前離心試劑管 

ProSpec 的細(xì)胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁 或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。 

有很多用戶會問一個問題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長時間離心試劑管，才能達(dá)到良好的收集效果？ 

答：有些小型高速離心機(jī)(多為進(jìn)口品牌)的面板上有一個 Spin 鍵，按了此鍵后，離心機(jī)會自動快速上升到其最大速度 (10000rpm 或 12000rpm)，上升到最高點(diǎn)后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個過程大約 30s。這個 Spin 鍵足以很好的將細(xì) 胞因子或蛋白收集到管底。但有些實(shí)驗(yàn)室沒有這樣的高速離心機(jī)，只有最高轉(zhuǎn)速為 4000-4500rpm 的離心機(jī)。這種情況下，需 3000-3500rpm 離心 5min，也能達(dá)到類似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。 

這個步驟即為溶解步驟，非常重要。 

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉 

用于溶解細(xì)胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人 IL-4 需用水溶解，而重組人 IL-2 (產(chǎn)品編號：CYT-209)則需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人 TGF-beta1(產(chǎn)品編號：CYT-716）需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (注：即使同一 重組細(xì)胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的官方 說明書為準(zhǔn))。后續(xù)的文章中將對各種溶解液的配制方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。 

經(jīng)常有用戶會問，為什么會有這么多種溶解方法？ 

答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是 pH 值和離子強(qiáng)度。ProSpec 的細(xì)胞因子或重組蛋白在 出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測試，說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的 pH 值和 離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時候會造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因 子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 

有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用 PBS 或培養(yǎng)液(1640 或 DMEM 等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的 凍干粉。這樣做可以嗎？

答：有時可以，要看具體情況。ProSpec 的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是 PBS，此時千萬不能用 PBS 或培 養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細(xì)胞因子，如重組人 KGF 和重組人 FGF-23 等，說明書上的溶解液即為 1x PBS，此時用 PBS 溶解完全沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過最好還是用先用 PBS 溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。 

2) 一定要溶解到指定的濃度。 蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，該例為 0.1-1.0mg/ml。 這個濃度范圍對于不同的細(xì)胞因子或重組蛋白是不同的。 

高于或低于該濃度范圍會有什么問題呢？ 

答：首先，細(xì)胞因子或蛋白會不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的 最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分 蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。 

3) 一定不能振蕩(vortex)。 

這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。 

有用戶會問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的完全溶解，該怎么辦呢？

答：多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子或重組 蛋白完全溶解。 

對于不易溶解的細(xì)胞因子或蛋白，ProSpec 會在說明書中進(jìn)行備注。這種情況下，您最好能將要溶解的細(xì)胞因子或重組 蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時間，促使細(xì)胞因子或重組蛋白完全溶解。 

3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1week. 

第 3 步：該重懸液在 2-8℃最長可保存 1 周。 

用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在 2-8℃，即冰箱的冷藏室。 在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性最長可保持 1 周。這對一個周期為 5-7 天的實(shí)驗(yàn)，如 DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是 足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。 

其實(shí)，說明書上推薦的濃度對于一般的實(shí)驗(yàn)來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在 4℃保存，待 1 周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第 4 步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很 容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20℃ to -80℃. 

第 4 步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如 0.1% BSA，或 10% FBS，或 5% HSA)的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃ 至-80℃。 

如果一個實(shí)驗(yàn)周期長于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長期保存。 方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如 0.1%BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。 

經(jīng)常有人會在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20℃至-80℃，這樣可以嗎？ 

答：不行。我們知道，塑料管壁對多數(shù)蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后， 蛋白是很難與管壁分離的。做過 ELISA 實(shí)驗(yàn)的人都知道，ELISA 的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶 標(biāo)板上的。 

載體蛋白，如 1% BSA，10% FBS(胎牛血清)和 5% HSA 等的主要作用是預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)胞因子 或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋，而直接 分裝凍存，則溶液中的大部分細(xì)胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實(shí)際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大為降 低，最終表現(xiàn)為細(xì)胞因子或重組蛋白活性的下降。 

因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大 量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。 

那么，含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？ 

答：水不可。該溶液通常是指 pH 近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如 PBS，培養(yǎng)液(RPMI1640, DMEM 等)等。 

還有一個經(jīng)常被問及的問題，即在做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時，細(xì)胞因子中不能含有 BSA，F(xiàn)BS 或 HSA 等動物或 人的蛋白，要想長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白該怎么辦呢？ 

答：一種方法是訂購 ProSpec 的小包裝細(xì)胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用后即廢棄。

5. 后續(xù)稀釋液的配方：即原產(chǎn)品的溶液的配方。 

總之，為保證細(xì)胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中 Reconstitution 的方法 嚴(yán)格操作。 

蛋白有價，實(shí)驗(yàn)無價，愿大家珍惜每次實(shí)驗(yàn)機(jī)會，嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真，每次均能得到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果！

1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子對小鼠細(xì)胞均有活性。

2) 許多小鼠細(xì)胞因子也可作用于人類細(xì)胞，但比活性可能低 于對應(yīng)的人類細(xì)胞因子。 

3) IL-7 等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時比對應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強(qiáng)。

4) 干擾素， GM-CSF, IL-3 和 IL-4 等細(xì)胞因子種屬特異，對非同源細(xì)胞幾乎沒有活性。

5) 相反，成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素 (neurotrophins)高度保守，在不同動物種屬細(xì)胞上均具有很好的活性。

ED50 為半數(shù)有效濃度，其定義是可誘導(dǎo) 50%最大反應(yīng)的細(xì)胞因子濃度，這種活性表示法僅適用于劑量反應(yīng)曲線呈 S 形 的細(xì)胞因子。其實(shí)，可以將 ED50 的值接理解為 1unit。如某種細(xì)胞因子或蛋白的 ED50 為 1ng/ml，那么 1ng/ml 即可看作是 1unit。 那么我們也不難理解，1mg(1x106ng) 該細(xì)胞因子或蛋白中應(yīng)含 1x106/1= 106units. ED50(ng/ml)轉(zhuǎn)化為 units/mg 的公式如下：

與市場上的許多蛋白產(chǎn)品不同，ProSpec 的產(chǎn)品中均不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白 (HSA)和蔗糖等，并且是以最低含鹽量的溶液進(jìn)行凍干的，因此凍干后常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過程 中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。打開管蓋前，我們建議您在小離心機(jī)中快速離心 20-30 秒，使附著在管蓋 或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準(zhǔn)確無誤，雖然有時您無法看到蛋白粉末，但管中的蛋白 含量仍是非常精確的。

除非在產(chǎn)品說明書中特別注明，ProSpec 相當(dāng)一部分產(chǎn)品為凍干粉，它們在室溫條件下非常穩(wěn)定(至少 1 個月)。盡管如 此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃，以確保蛋白 100%的活性。對于大多數(shù)蛋白，重懸后在 4℃僅能短期保存 (約 1 周)。如想長期保存，請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如 0.1% BSA，5%HSA，或 10% FBS)，然后分裝凍存于 -20℃或-80℃。一定要避免反復(fù)凍融，因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。

WB           Western Blot

WB-Ce   Western Blot (Cell lysate)         細(xì)胞裂解液（天然細(xì)胞，內(nèi)源）

WB-Re   Western Blot (Recombinant protein)   重組蛋白（外源轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到細(xì)菌，表達(dá)蛋白）

WB-Ti   Western Blot (Tissue lysate)      組織裂解液（天然組織，內(nèi)源）

WB-Tr   Western Blot (Transfected lysate)      轉(zhuǎn)染裂解液（外源轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到細(xì)胞，表達(dá)蛋白）

實(shí)驗(yàn)類型選擇優(yōu)先（涵蓋范圍）：

WB > WB-Ti > WB-Ce  

WB-Re 和 WB-Tr，不推薦。如果客戶購買，建議跟客戶講一下，非官網(wǎng)承諾應(yīng)用類型，廠家不受理投訴。

【以1：500稀釋比，30ul的小包裝抗體為例】

1:500稀釋 = 500ul 抗體稀釋液中加入1ul原始抗體 ==》30ul原始抗體可以配置成為30ul * 500 = 15ml的稀釋后的抗體【工作液】，一張玻片一般用50ul的抗體工作液 = 15 ml / 50ul = 300張

如果是1:200稀釋的話，= 120張

作業(yè)：WB實(shí)驗(yàn)，一條膜通常需要1ml的工作液（1:1000稀釋的話，需要加入1ul原始抗體溶液），實(shí)驗(yàn)次數(shù)自算？

PS: 1 ml = 1000 ul

· ELISA比色法實(shí)驗(yàn)顯色，是一個酶催化的實(shí)驗(yàn)。在一定范圍內(nèi)，環(huán)境溫度越高，酶活性越強(qiáng)，相同孵育時間內(nèi)，溫度高的，檢測數(shù)據(jù)高。相同溫度，孵育時間長的，檢測數(shù)據(jù)高。

· 說明書的標(biāo)曲只是一個參考用途，展示大概的結(jié)果形式。不能直接使用，否則，試劑盒就沒有必要提供標(biāo)準(zhǔn)品了，客戶直接用說明書的曲線來計算了，對吧。【每次實(shí)驗(yàn)，當(dāng)時都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，才是最準(zhǔn)確的方法】

· 標(biāo)準(zhǔn)曲線是否良好？ 客戶可以繪制相應(yīng)的擬合曲線（線性，或者曲線形式），R2大于0.9以上是可以接受的，0.99那就是非常好，小數(shù)點(diǎn)后面9越多越好。

* 試劑盒規(guī)格的48或者96，通常代表的是反應(yīng)次數(shù)或者孔的數(shù)量。而不是樣品數(shù)量。（標(biāo)準(zhǔn)品，對照都會參與到反應(yīng)或者加入到孔中，因此樣品數(shù)量肯定會少）

試劑盒做一次實(shí)驗(yàn)，需要客戶做：6個標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，根據(jù)各個說明書里面說的來設(shè)置，6個濃度點(diǎn)）+ 一個空白孔（標(biāo)準(zhǔn)含量為0） = 7。通常每個實(shí)驗(yàn)都要做復(fù)孔（最少2個復(fù)孔，也有做3個復(fù)孔的。2個復(fù)孔意味著1個東西，需要加到2個孔，統(tǒng)計學(xué)需求，算平均值等），這么一來被占用的孔就是7*2=14個孔。96-14=82個孔，只有這82個孔可以給客戶拿去測試他的樣品。如果也算是復(fù)孔，那么就是82/2=41個樣品。這是最多可以測試多少樣品。

總結(jié)：

【2個復(fù)孔】樣品數(shù)量= [ 96 - （標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量+對照組數(shù)量）*2] / 2

【3個復(fù)孔】樣品數(shù)量= [ 96 - （標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量+對照組數(shù)量）*3] / 3

#強(qiáng)調(diào)#：標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量，陽性對照，陰性對照 的設(shè)置，根據(jù)說明書來，有些試劑盒是沒有陽性對照的。

以上為一次性將試劑盒用完的樣品數(shù)量。如果客戶要做2次實(shí)驗(yàn)，需要繪制2次標(biāo)曲。對應(yīng)的，繼續(xù)相減。

1. 主要涉及ATP類的試劑盒，消耗能量ATP，發(fā)光（螢火蟲）。

2. 主要的實(shí)驗(yàn)：熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)。

使用儀器：

1. 化學(xué)發(fā)光儀，

2. 光度計（Luminometer），

3. 多功能酶標(biāo)儀（含化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光檢測模塊）。

1.試劑盒使用前，通常需要在室溫下平衡30-60min。(溫度對酶催化反應(yīng)有影響）。

2.洗板時需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔，但盡量避免漏液溢液，以每孔300 μl為宜；板洗次數(shù)一般為3次，要保證洗板的浸泡時間，每次浸泡時間一般為30-60 秒；盡量減少洗液殘留量，推薦每次洗板后進(jìn)行拍板，并及時更換吸水紙，避免吸水紙的碎屑粘到反應(yīng)孔內(nèi)。