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TECHNICAL COLUMN

常見問題

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問

怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

答

影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個因素：
（1）電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠 55v，分離膠75v 就能跑得很好。
（2）膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.
問

封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4 度下?

答

均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4 度過夜。
問

轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是 5%的TBST 脫脂奶粉”，其中TBST 最后那個 T 是 Tween 嗎，濃度多大？

答

是 Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),NaCl：8g，Trisbase：2.42g加水 800ml 溶解,加500-1000ul 的Tween-20,用HCl 調(diào)節(jié) pH至7.4,加水定容至1L。
問

做半定量WesternBlot，內(nèi)參 β-actin，GAPDH 哪個好？

答

選用beta-actin 就可以。
問

想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū) 別嗎？

答

一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。
問

核內(nèi)抗原WesternBlot 內(nèi)參選擇什么合適？

答

可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的，有很多都可以當成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。
問

我用的是可視 marker，但是電泳總跑不全 8 條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過 8％，10％，12％，都是這樣。marker 是新買的。

答

一般來說，是小分子量Marker 跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。
問

是否 WesternBlot 實驗半定量一定要加ACTIN 內(nèi)參？

答

對于發(fā)表文章的實驗最好加內(nèi)參，實驗嚴謹。
問

不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

答

可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC 膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn) 移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC 膜（0.2 微米）。
問

蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小 21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答

這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd 和66kd 可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn) 120mA，45-60min 就可以了，可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE， 200mA90-120min。
問

跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？

答

沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。
問

上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。

答

無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。