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TECHNICAL COLUMN

常見問題

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問

用什么96孔板？

答
問

96孔板：Solid plate & Strip（條） plate

答
問

比色法 & 熒光法：哪個更好？

答

比色法：特定波長光穿透樣品，光被吸收的情況。（酶標儀）（分光光度計）
熒光法：特定波長光，激發(fā)染料，發(fā)出其它波長光的情況。（熒光/多功能，酶標儀）
問

如何確認同一個蛋白（產(chǎn)品替換）

答

1.找到這個抗體的免疫原，什么蛋白的抗體。【留意應用類型和反應種屬】或者，在【靶標】這一欄觀察，SwissProt 這一欄，至于是選人的還是小鼠的，根據(jù)客戶實驗需求來。可以點擊進去，進入 Uniprot 數(shù)據(jù)庫。
2. (Uniprot ID: P25054).這是數(shù)據(jù)庫的 ID，類似身份證，打開數(shù)據(jù)庫：http://www.uniprot.org/ ，輸入 ID，P25054，搜索。
3.
全名如圖，可以用全名和縮寫去搜索抗體。并在其它品牌的產(chǎn)品頁面，留意觀察抗原的信息，是否與數(shù)據(jù)庫的一致 ···這個 ID 相同，就像身份證號碼一樣，指示是同一個人。
案例：（問題，是否為同一個蛋白，是否可以替換為 Abbkine 產(chǎn)品）
1. http://www.alomone.com/p/anti-angiotensin-(1-7)_mas_receptor/agp-099/119
2. http://www.abbkine.com/product/mas1-polyclonal-antibody-abp57206/
問

其它現(xiàn)象：

答

●膜上多處出現(xiàn)黑點或黑斑原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。
●反白（條帶顯白色）原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?nbsp;
●蛋白分子量偏低或偏高原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。
問

Westernblot 結(jié)果中無信號或顯示信號弱

答

可能的原因及建議：
●檢測樣本不表達目的蛋白選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。
●檢測樣本低表達目的蛋白提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
●轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流。
●抗體不能識別測試種屬的相關蛋白購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。
●一抗孵育時間不足建議 4℃結(jié)合過夜。
●二抗與一抗不匹配選擇針對一抗來源的種屬的抗體。
●洗膜過度洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑 Tween-20。
問

安全問題：

答

操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發(fā)性試劑應在通風櫥中進行。
問

Westernblot 結(jié)果中雜帶較多

答

可能的原因及建議：
●目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現(xiàn)多條帶。查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。
●目的蛋白有其它剪切本查閱文獻或生物信息學分析可能性。
●樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。
●上樣量過高，太敏感適當減少上樣量。
●一抗特異性不高重新選擇或制備高特異性的抗體。
●一抗不純純化抗體
●一抗或者二抗?jié)舛绕呓档涂贵w濃度。
問

電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：

答

●︶條帶呈笑臉狀原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;電泳系統(tǒng)溫度偏高。
●︵條帶呈皺眉狀原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。
●拖尾原因：樣品溶解不好。
●紋理（縱向條紋）原因：樣品中含有不溶性顆粒。
●條帶偏斜原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。
●條帶兩邊擴散原因：加樣量過多。
問

Westernblot 結(jié)果中背景較高

答

可能的原因及建議：
●膜封閉不夠延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。
●一抗稀釋度不適宜對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
●一抗孵育的溫度偏高，建議 4℃結(jié)合過夜。
●選擇的膜容易產(chǎn)生高背景，一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF 膜低。
●膜在實驗過程中干過實驗過程中要注意保持膜的濕潤。
●檢測時曝光時間過長，減少曝光時間。
問

為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時候，小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?

答

小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。
問

請問一下 PVDF 膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

答

一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF 膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF 膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。